酵素動力學

 

 

 

 

 

一、酵素活化中心(The active center of an enzyme)

二、活化位置的化學變型(Chemical modification of the active site)

三、活化位置指引試劑(Active-site-directed reagents)

四、水解酶的活化位置胺基酸(Active-site residues of hydrolytic enzymes)

五、特化位置(The specificity site)

六、對酶的構造與功能的註解(Comments on enzyme structure and function)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

一、酵素活化中心(The active center of an enzyme)

 

每一個酵素催化反應,基質(不管是大分子或小分子)會與酵素的特別位置結合,形成酵素-基質錯化物(ES錯化物)。以ES錯化物的形式,基質分子就可進行空間構造的改變,產生鍵的斷裂與形成過渡狀態,使基質轉變成產物。因為基質多為小分子,因此,對酵素的特異結合(ES錯化物)只是在酵素構造的一小區域。參與基質反應的酵素區域叫活化中心(active center)。活化位置(active site)則是與催化有關的活化中心部分。特化位置(specificity site)是接近活化位置的酵素區域,與基質結合並適當地把基質導入活化位置。

 

二、活化位置的化學變型(Chemical modification of the active site)

 

利用化學試劑造成酵素活性的喪失,可鑑定活化位置的胺基酸。為了要確定inactivation是在活化位置的胺基酸,而非在遠離活化位置的某些決定性構造元素上,因此,以化學試劑進行inactivation,必須受基質或基質類似物的抑制。因為基質或競爭性抑制劑與活化位置區域結合,空間的阻礙可以阻止化學試劑的接近。活化位置的化學變型,以化學衍生物的形式標定了決定性的胺基酸。酵素的胺基酸分析,直接鑑定參與反應的胺基酸,並且在酵素衍生物的順序分析中,出現化學衍生物者,便是特殊胺基酸的位置。

 

以下以乳凝蛋白酶為例,說明酵素的作用。乳凝蛋白酶和許多其他的酶,與二異丙氟磷酸(di-isopropylphosphofluoridate)作用時,便被inactived,這是一種極強的神經毒劑,能抑制中樞神經系統的酶-乙醯膽脂鹼酶(acetylcholoinesterase)。該試劑與酶的反應會形成穩定的二異丙基磷酸的衍生物。

 

變型的位置是在乳凝乳蛋白酶27serine中的一個,位於195號(指牛的乳凝蛋白酶原A的胺基酸編碼)。因為inactivation只能使用酶的活化型,而不能用變型蛋白質分子或無活性的酶原,serine 195可認為是活化位置的部分。對於這種指認,有進一步的證據:當乳凝蛋白酶的基質與二異丙氟磷酸競爭活化位置時,滅化的速率就減低了。

 

每一分子的乳凝乳蛋白酶結合一個甲苯磺酸基,且化學分析得知只有一個serine被甲苯磺酸化。甲苯磺酸化的乳凝乳蛋白酶,在0o0.1M的氫氧化鈉下,進行鹼-消去反應,並形成祛水乳凝乳蛋白酶(anhydrochymotrypsin)。反應的狀況要很緩和,以保持它的原本構造;唯一的改變是serine 195轉變成dehydroalanine。祛水乳凝乳蛋白酶性質穩定,沒有酵素催化的活性,但能結合基質(形成ES錯化物)和抑制劑。催化活性的喪失,顯示serine 195在酶的催化作用上所擔任的角色,是它為活化位置的一部份,而非特化位置的一部份。祛水乳凝乳蛋白酶少許的改變,消除了活化區域可能的空間阻礙。

 

三、活化位置指引試劑(Active-site-directed reagents)

 

乳凝乳蛋白酶活化位置的化學變型,可使用活化位置指引劑做進一步的證明;這種試劑的反應受酶的特異性指引,而與酶形成共價鍵。此酶的典型基質是N-甲苯磺酸酚丙胺酸乙酯(N-tosylphenyalanine ethyl ester),但SchoellmannShaw卻製備了N-甲苯磺酸酚丙胺酸氯化甲酮(N-tosylphenylalanine chloromethyl ketone)TPCK作為活化位置的抑制劑。這種基質類似物符合酶對酚丙胺基(phenylalayl group)的特異性要求,但是缺少了可水解的肽鍵(peptide bond)。

 

TCPK與乳凝乳蛋白酶在通常狀況下,與酶的催化位置以一比一的化學計量反應。只有原酶(native enzyme)參與反應,至於乳凝乳蛋白酶原、變性的乳凝乳蛋白酶、二異丙磷酸的衍生物和祛水乳凝乳蛋白酶皆不反應。乳凝乳蛋白酶活化基為兩個histidine中的一個嘧唑(imidazole),胺基酸順序的號碼為57。從乳凝乳蛋白酶的化學變型研究,得知serinehistidine都參與催化作用,因此,二者都是活化位置的成分。而且,serine 195的衍生物會阻止histidine 57的化學變型,histidine的衍生物也保護serine。因此,有這樣的假設:serine 195histidine 57的活化和其催化的角色,導因於serine的醇基與histidine的嘧唑間的某種反應形式,這兩個胺基酸都是氫鍵系統的一部份。

 

四、水解酶的活化位置胺基酸(Active-site residues of hydrolytic enzymes)

 

以化學變型技術鑑定水解酶的活化位置胺基酸,得知活化位置的胺基酸,只有一小部分不相同。除了serine蛋白酶的serine-histidine外,其他家族的活化位置還有cysteine-histidinehistidine-histidine,和glutamic acid-aspartic acid。該表還可加上已被認定的酶活化位置而擴大。

 

 

胺基酸a

乳凝乳蛋白酶b

Ser 195-His 57-Asp 102

木瓜酵素

CySH25-His 159-Asn 175

核醣核酸酶

His 12-His 119

溶菌酶

Glu 35-Asp 52

羧太酶

Glu 270-Tyr 248

a: 這些胺基酸是數種已知順序和x光構造的酶,它們的活化位置部分。          

b: 胺基酸號碼是參照牛的乳凝乳蛋白酶原A的順序。

 

雖然serine 195histidine 57在乳凝乳蛋白酶的胺基酸順序上。相隔甚遠,但是在三度空間構造上卻彼此接近。作為活化位置的成分,serine 195histidine 57的支鏈接近基質的肽鍵,並參與鍵的切割,這是酵素催化作用的一部份。

 

由於Blow對乳凝乳蛋白酶的X射線晶體圖的成就,和Hartley對此酶的胺基酸順序的建立,使我們能瞭解此酶完整的三度空間構造。為了更明瞭活化中心的反應機構,三度空間構造的考慮是必須的。

 

五、特化位置(The specificity site)

 

X-射線也可給乳凝乳蛋白酶的特化位置,提供了確定的情報。由電子密度圖可以看出,這個區域與甲苯磺酸基結合,這是根據酶對芳香族構造的已知特異性而提出的合理假設。甲苯磺酸位於酶表面的洞內,稱為甲苯磺酸洞,在此洞上,芳香族基與排列在洞上的疏水基作用。洞口的大小可容納一般基質的支鏈取代物,被結合的基質正確地指向酶並水解肽鏈。

 

N-formyl tryptophan結合到乳凝乳蛋白酶,再作X-射線繞射圖的研究,也可證明此看法。N-formyl tryptophan是實質上的基質,這是N-formyl tryptophan相對應的酯類或醯類的水解產物,他結合到酶的模式就如同一般進行水解的基質。甲苯磺酸洞實際上是基質的結合位置,它可容納引朵基。

 

六、對酶的構造與功能的註解(Comments on enzyme structure and function)

 

生物活性與酶的完整構造有關,這種構造使分子保持了特別的三度空間排列。蛋白質的構造,使此巨分子以特別的模式與基質分子結合-這一特性說明了適當基質分子的選擇,以及酶參與催化作用時,基質的適當方向。催化活性是由活化位置的一些胺基酸誘導出來的,這一區域位於酶的表面,極接近結合的基質分子。活化位置的官能基參與基質轉變為產物的化學反應,因此,活化位置的排列,位於使胺基酸參與親質、親電和一般酸鹼的催化。

 

α-乳凝乳蛋白酶繞射研究所得知的催化效果a

 

催化效果

由乳凝乳蛋白酶的X-設線繞射得到的相關資料

鄰近周圍

增加活化位置的基質濃度

基質結合到CO(Ser 214)…HN(基質)氫鍵的洞內

方向

限制ES錯化物形成產物模式的可能構造

相同

專一性

限制基質結合到產物模式的種類

相同

誘導性密接

基質的結合改變了對產物模式的構造

乳凝乳蛋白酶中不發生

基質的扭曲

基質朝向過渡狀態作能量性的扭曲

目前無法測知結果,但是從NH(193)NH(195)結合到基質CO的氫,對此扭曲有所貢獻

酶的扭曲

儲存在酶中的能量可誘導過渡狀態的活化能

Asp 102…His 57,,,Ser 195電荷傳遞系統

化學催化

一般酸鹼,親質性等

His 57Ser 195間極化的氫鍵可能有關

化學中間物

較所有過程都低之活化能的各別反應步驟

穩定醯-酶的構造

a 取自R. Henderson, C. S. Wright, G. P. Hess, and D. M. Blow, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 36, 63 (1972)

 

 

活化中心在酶的構造區域中,是絕對需要的,而且其構造特徵也說明了使酶的行為具專一特性和催化效果。但是,只有一小部分的酵素構造,對活化中心的形成有所貢獻,分子的其餘部分只是必須的支架,這種構造支持物使活化中心的胺基酸,保持適當的三度空間排列。

 

 

    參考資料: 王立禾, 阮立昂譯  蛋白質構造與功能 P133~148  復漢出版社 (1977)

 

整理: 黃信明