酵素活性分析
若某一化學物質可吸收某一波長的光 (如H2O2可吸收波長240 nm的光)，則該化學物質在溶液中的濃度，會與溶液對該波長的吸光值(absorbance)成一正比關係，因此利用分光光度儀(spectrophotometer) 測定吸光值後，即可推知該化學物質在溶液中的濃度。
化學物質在波長l的吸光值(Al; absorbance)定義為Al = log(I0/I)。吸光值另稱為optical density (OD )。吸光值(或OD值) 只為一個數值，並無單位。 I0 (incident light density): 為分光光度儀所放出波長l的光束強度。I (transmitted light intensity): 為I0經過溶液及石英管後，所穿透出的光束強度
化學物質在波長l的吸光值(Al)與下列兩項因子成一正比關係:
(1) 化學物質在溶液中的濃度 ( C; 單位: M或mg/ml 等)。
(2) 所用石英管(cuvette)的寬度(l; 單位: cm )。
此正比關係稱為Beer’s law (或Beer-Lambert law): 即Al = el C l
el:為一比例常數(proportionality constant)，稱為該化學物質在波長l的extinction coefficient，單位為 mM-1 cm-1 或liter mol-1 cm-1等。el 可經由實驗求得，即先配製不同濃度的化學物質，在波長l及固定寬度的石英管中，測定吸光值，即可依實驗所得的數據，求得el。例如，H2O2在波長240 nm的el = 0.0395 mM-1 cm-1。
抽出液中含有多種蛋白質，這些蛋白質中，有些則具有某些酵素活性。例如，種子抽出液中，含有多種酵素，其中有一種即為a-amylase。抽出液中，某一種酵素含有多少量，通常以實際的酵素活性表示，常用的單位有兩種:
(a) 以units/ml表示，即1 ml 的抽出液中含有多少unit (單位)的該種酵素活性。
(b) 以unit/mg表示，即抽出液中，每1 mg 的蛋白質含有多少unit (單位)的該種酵素活性，此表示方法，稱為抽出液中所含有該酵素的比活性(specific activity)。對某一酵素而言，抽出液的比活性愈高，則抽出液含有該酵素的純度愈高。
(2) 酵素活性單位(unit)，指在單位時間(通常為分鐘)內，酵素使受質減少(或產物增加)的量。受質減少(或產物增加)的量，可視實驗的需求或方便性，以莫耳(mole)、克(g)、OD吸光值等表示。例如: 1 unit 可表示在一分鐘內，可使受質減少(或產物增加) 1 mmole; 亦可表示為在一分鐘內，可使受質減少(或產物增加) 1 mg; 或可表示為在一分鐘內，可使受質的OD吸光值減少0.1 (或是0.01等等)。
例如:
O. D.值變化量
活性
=
(樣品蛋白質含量) X (反應時間-分鐘)
酵素反應的速率，以最初反應速率(initial
velocity)表示，單位為mmoles/min，亦可以mmoles/liter-min表示。
在適當條件[適當溫度、pH 值、及離子強度(ionic strength)等]，且酵素的受質量很足够 (即最初的受質濃度大於酵素濃度時)的情況下，加入一定量的酵素溶液，則在不同時間後，受質的減少量(或產物的增加量)呈現如下列的圖形中的曲線。在曲線上的每一點的切線(如圖中的1, 2, 3)的斜率，為在該時間的反應速率。因此，在同一個最初的受質濃度，若取不同時間點，則會有不同的反應速率。通常在特定的最初受質濃度下，酵素反應的速率，均以最初反應速率(initial velocity; 即酵素反應開始進行時的速率)表示。因此，在曲線上取的點，若越接近原點，則該點的切線的斜率，越接近最初反應速率，如下圖中，切線1的斜率可視為酵素在某一最初受質濃度之下的最初反應速率。
植物組織抽出液，經蛋白質定量後，抽出液含有20 mg/ml的蛋白質。在反應體積為0.5 ml，內含10 ml抽出液，以測定抽出液中酵素A的活性。在適當條件下[適當pH 值、離子強度(ionic strength)、所有受質為飽和濃度等]，酵素A一分鐘內，可催化產生3 mmoles 產物。請計算:
(1) 酵素-催化反應的最初反應速率(initial velocity)，
(1-1) 以mmoles/liter-min 表示。
(1-2) 以mmoles/min 表示。
(1-3) 如在標準反應體積1.0
ml下，取10
ml萃取液進行反應，則反應速率為多少
mmoles/liter-min。
(2) 抽出液中酵素活性(enzymatic activity):
(2-1) 抽出液的酵素A活性，以units/ml 表示，
(2-2) 抽出液的酵素A的比活性，以unit/mg protein 表示。
解答:
(1) 酵素-催化反應的最初反應速率:
(1-1) 以mmoles/liter-min 表示。
n = (3 mmoles/min)/0.5 ml = (3 mmoles/min)/0.5 ´10-3 liters
= 3/(0.5´10-3) mmoles/liters-min
n = 6´103 mmoles/liters-min
(1-2) 以mmoles/min 表示。
n = 3 mmoles/min
(1-3) 如在標準反應體積1.0 ml下，取10 ml萃取液進行反應，則反應速率為多少mmoles/liter-min。
n = (3 mmoles/min)/1.0 ml = (3 mmoles/min)/1.0 ´10-3 liters
= 3/(1.0´10-3) mmoles/liters-min
n = 3´103 mmoles/liters-min
或可以下列方法計算:
因反應總體積加倍，造成酵素濃度減半，因此反應速率(mmoles/liter-min) 將減半。所以
n = (3 mmoles/min)/1.0 ml = (3 mmoles/min)/1.0 ´10-3 liters
= (6´103 mmoles/liters-min)/2
n = 3´103 mmoles/liters-min
當反應體積增加時，產物總量依然不變。雖然mmoles/liter-min 的反應速率減半但反應總體加倍。因所有的反應均在受質的飽和濃度下進行，每一反應的反應速率為Vmax 值。
(2) 抽出液中酵素活性(enzymatic activity):
(2-1) 抽出液的酵素A活性，以units/ml 表示，
1 unit 定義：在適當反應條件下，每分鐘催化產生1 mmoles 產物所需的酵素量。因此，反應速率3 mmoles/min 相當於3 units。以10 ml 萃取液產生3 units，
酵素A活性= 3 units/10 ml = 3 units/0.01 ml
酵素A活性 = 300 units/ml
(2-2) 抽出液的酵素A的比活性，以unit/mg protein 表示。
比活性(specific activity)定義：每毫克(mg) 蛋白質所含酵素units。
比活性= (300 units/ml)/(20 mg protein/ml)
比活性= 15 units/mg protein
含有catalase的蛋白質溶液中，含有蛋白質的濃度為 0.5 mg/ml，取 200 ml 至H2O2溶液中，使最後測試溶液的總体積為1 ml，並以分光光度儀(spectrophotometer) 測定OD240。一開始測的OD240 = 0.1，經過一分鐘後，OD240 降至 0.054，請求出含有catalase的蛋白質溶液的catalase的比活性 (mmol/min/mg)。 (石英管的寛度為1 cm; H2O2在波長240 nm的el = 0.0395 mM-1 cm-1)。
註:
1. catalase 催化以H2O2為還原劑，將H2O2還原成H2O的反應: H2O2 + H2O2 -> O2 + 2 H2O。
2.
含有酵素的蛋白質溶液的比活性(specific activity)，以unit/mg表示，
即溶液中，每1
mg 的蛋白質含有多少酵素活性單位(unit)。
3. 酵素活性單位(unit)，指在單位時間(通常為分鐘)內，酵素使受質減少(或產物增加)的量，
單位可為
mol/min。
解答:
1. 以Beer’s law (Al = el C l)計算一分鐘之內，測試溶液中受質(H2O2)的減少量:
(1) 一分鐘內OD減少值：0.1-0.054
= 0.046
∵ Al = el C l
∴ 0.046 = 0.0395 (mM-1cm-1)´C´1(cm)
C = 0.046/0.0395 (mM-1) = 1.165 mM
∴一分鐘內受質(H2O2)減少1.165 mM
(2) 測試溶液總體積為1 ml
1.165 (mM) ´1 (ml) = [1.165´10-3 (M)]´[1´10-3 (L)]
= 1.165 ´10-6mole = 1.165 mmole
∴ 一分鐘內受質(H2O2)減少1.165 mmole
∴ 酵素活性單位(unit) = 1.165 mmole/min
2. 計算測試溶液中蛋白質的含量:
0.5 (mg/ml)´200 (ml) = 0.5 (mg/ml)´0.2 (ml) = 0.1 mg
∴ 溶液中含有蛋白質0.1 mg
3. 計算溶液的catalase的比活性:
比活性 (unit/mg) = 1.165 (mmole/min)/0.1 (mg) =11.65 mmole/min/mg